Alphavirus-based delivery of chitinase-like-protein gene for anti-tumour programing of macrophages (Project Alpha-Chit)

Ученые ТГУ и Томского НИМЦ в кооперации с коллегами из Гейдельбергского университета и Латвийского биомедицинского исследовательского центра разрабатывают принципиально новый подход к лечению онкологических заболеваний. Его суть в том, чтобы «научить» клетки, присутствующие в микроокружении опухоли, препятствовать ее росту и метастазированию. Проект реализуется при поддержке РФФИ и международной программы «ERA.Net RUS plus».

НИ ТГУ: Исследователи будут «учить» макрофаги подавлять прогрессию опухоли http://www.tsu.ru/news/issledovateli-budut-uchit-makrofagi-podavlyat-prog/
ТН ИМЦ: Исследователи будут «учить» макрофаги подавлять прогрессию опухоли http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/issledovateli-budut-uchit-makrofagi-podavlyat-progressiyu-opukholi/?sphrase_id=7907
НИ ТГУ: Ученые выясняют, как опухоль «переманивает» иммунитет на свою сторону http://www.tsu.ru/news/uchenye-vyyasnyayut-kak-opukhol-peremanivaet-immun/

Summary

Development of anti-tumour drugs is a highly relevant and timely aim of biotechnology considering aging of the population and increasing socio-economic significance of cancer. Targeting only cancer cells is insufficient to stop tumour growth and metastatic spread. Recent data indicate that tumour microenvironment is essential regulatory component deciding about tumour progression. Tumour-associate macrophages (TAM) constitute a key regulatory component of tumour microenvironment. Tumour cells program TAM for their needs to support tumour cell proliferation, angiogenesis and metastasis. However, TAM possess all the necessary tools to stop tumour progression. The most advance approach to instruct macrophages to stop supporting tumour progression and to act against tumour is their functional reprogramming. In our previous ERNR-Rus DTEST-CLP project we identified SI-CLP as a novel tumour suppressor that inhibits tumoursupporting functions of TAM in pre-clinical animal model. The goal of the current multidisciplinary collaborative project is to design an efficient and safe gene therapy approach to deliver SI-CLP to tumour sites and to increase the SI-CLP anti-tumour properties by introducing additional mutations to enhance TAM reprogramming effect. For the delivery of SI-CLP into tumour we will design advanced alphavirus based vectors and examine them in in vivo and ex vivo preclinical experimental models for the TAM reprogramming and suppression of tumour progression. By analysis of clinical material from patient with breast and colon cancer we will identify the range of tumour stages for the therapeutic interventions. Alpha-Chit will result in an innovative gene therapy approach to activate anti-tumour functions of TAM that can be used alone or in combination with chemotherapy. Alpha-Chit product will be ready for the stage I clinical trials. In future we plan to upscale our collaboration applying for funding for clinical studies by EU program Horizons 2020.

Scientific and/or technological objectives

The goal of Alpha-Chit is to develop innovative gene therapy tools based on the alphaviral vectors expressing chitinase-like protein SI-CLP for the activation of anti-tumour functions of TAM and inhibition of tumour growth.

Background and expertise of the team members

University of Heidelberg (UHEI) team: Prof. Dr. J. Kzhyshkowska, head of Dept of Innate Immunity and Tolerance, WP1 leader FP7 IMMODGEL project, international leading expert in macrophages biology and programming. Dr. V. Ryabov, senior postdocs, expert in mouse tumor models, TAM isolation, macrophage programming, Dr A. Mickley, expert in confocal microscopy, Ms C. Schmuttermaier, TA, monocyte isolation, immunolgocal techniques, new PhD student will be requited for functional experiments.

Latvian Biomedical Research and Study Centre (LBMC) team: Dr.A.Zajakina, WP1 leader, is a key expert in alphavirus-mediated transgene delivery and national coordinator of European Biotechnology Thematic Network Association. Dr. T. Kozlovska and Dr. D.Skrastina senior experts in recombinant alphavirus vectors and animal studies. Dr.D.Žulenkovs, young postdoc with deep knowledge in drug design and medicinal chemistry. J.Vasilevska, PhD student, 3y experience in alphavirus production. New PhD student will be required

Tomsk State University (TSU) team: Prof. Dr. N. Cherdyntseva, international expert in clinical and experimental oncology. Prof. M.
Zavjalova, cancer pathologist, Dr. N Litviakov, senior expert in cancer genetics, Dr. Michael Buldakov, young postdocs, tumor histology, confocal microscopy; Ms. T Gerashchenko, PhD student, macrophage isolation. New PhD student will be required for ex vivo studies.

Аннотация проекта

Создание эффективных противоопухолевых лекарственных средств – высоко актуальная задача биотехнологии в связи с интенсивным процессом постарения населения и, соответственно увеличением социально-экономической значимости злокачественных новообразований.
Стандартная терапия, направленная только на уничтожение злокачественных клеток, часто является неэффективной и не приводит к регрессии опухоли и ингибиции метастазирования. Наиболее современные данные указывают на то, что опухолевое микроокружение является решающим фактором, определяющим опухолевую прогрессию. Макрофаги, ассоциированные с опухолью (МАО) являются ключевыми элементами регуляции опухолевого микроокружения. Опухолевые клетки могут программировать макрофаги в направлении поддержания пролиферации опухолевых клеток, стимуляции ангиогенеза и гематогенной диссеминации опухолевого процесса. Однако макрофаги потенциально обладают всеми необходимыми функциями (свойствами) для того, чтобы препятствовать опухолевому росту и метастазированию. Наиболее перспективным подходом для «инструктирования» макрофагов с целью ингибиции опухолевой прогрессии и реализации их повреждающего влияния на опухоль рассматривается репрограммирование их функциональной активности. Ранее нами было показано, что стабилин-связанный хитиназо-подобный белок (SI-CLP) является новым опухоле-супрессорным фактором, который ингибирует способность макрофагов поддерживать рост опухоли в доклинических моделях. Целью настоящего междисциплинарного совместного проекта является разработка эффективного и безопасного подхода генной терапии, основанного на доставке SI-CLP к опухоли и увеличении противоопухолевых свойств SI-CLP для усиления репрограммирующего эффекта в отношении макрофагов. Для доставки SI-CLP в опухоль планируется разработать новые векторы на основе альфавирусов и протестировать эффективность их действия in vivo и ex vivo в доклинических экспериментальных моделях в отношении эффективности репрограммирования макрофагов, ассоциированных с опухолью и подавления прогрессии опухолевого процесса. При анализе материала от больных раком молочной железы и раком кишечника планируется идентифицировать стадии опухолевого роста, наиболее подходящие для терапевтического воздействия с помощью разрабатываемого подхода. Выполнение проекта Alpha-Chit позволит создать новый терапевтический подход для активации противоопухолевой функции макрофагов, который может быть использован как самостоятельно, так и в комбинации с химиотерапией. Продукт, созданный при выполнении Alpha-Chit, будет подготовлен для первой стадии клинических исследований. В будущем по результатам проекта предполагается подать совместную заявку на финансирование клинических исследований в рамках программы Horizons 2020.

Список исполнителей:

Иванюк Елена Эдуардовна
Якушина Валентина Дмитриевна
Савельева Ольга Евгеньевна
Литвяков Николай Васильевич
Булдаков Михаил Александрович
Ларионова Ирина Валерьевна
Завьялова Марина Викторовна
Чердынцева Надежда Викторовна

Аннотация отчета за 2016 год

Общей целью коллаборационного проекта является разработка инновационных инструментов генотерапии на основе альфавирусных векторов, экспрессирующих хитиназо-подобный белок SI-CLP, для активации противоопухолевой функции опухолеассоциированных макрофагов и ингибиции опухолевого роста. Для разработки модельной системы моноцитов с целью получения программированных с помощью цитокинов макрофагов для оценки влияния на них SI-CLP проведена оптимизация получения моноцитов из крови онкологических пациентов. При помощи иммуногистохимического анализа выявлены фенотипы внутриопухолевых макрофагов, сопряженных с эффективностью неоадьювантной химиотерапии (НАХТ) у больных раком молочной железы. Оригинальность исследования состоит в том, что идентификация опухолеассоциированных макрофагов проводилась с учетом их локализации в том или ином участке опухоли, которые различаются по характеру взаимоотношений паренхиматозного и стромально-воспалительного компонентов, очевидно, определяющих функциональные особенности и биологическое поведение макрофагов в отношении опухоли. Для оценки связи экспрессии макрофагальных маркеров с эффективностью неоадьювантной химиотерапии в исследовании применен оригинальный дизайн, который заключался в том, что оценивали связь маркеров с эффективностью НАХТ в 2-х группах пациентов, различавшихся по принципу назначения химиотерапии. Ретроспективно всех больных ранжировали на группу с правильно назначенной схемой лечения (то есть соответствующей результатам тестирования молекулярно-генетических маркеров опухолевых клеток) и группу с «неверно» назначенными препаратами (назначение несоответствующей схемы лечения). При правильном назначении состав химиопрепаратов соответствует их мишеням, экспрессируемым в опухоли каждого больного индивидуально, при неправильном – не соответствует. Получены новые данные о связи экспрессии хитиназо-подобных белков в биопсийном материале рака молочной железы до проведения лечения с эффективностью химиотерапии и отдаленными показателями безметастатической выживаемости пациентов. Установлены комбинации маркеров макрофагов 2 типа, указывающие на резистентность опухоли к химиотерапии при правильно подобранной схеме НАХТ, а также на ответ опухоли на химиотерапию даже при неверно подобранной схеме, то есть не в соответствии с молекулярно-генетическими маркерами. Приоритетные данные по макрофагальным маркерам ответа на химиотерапию буду оформлены в виде патентной заявки. Установлено, что более высокий уровень экспрессии SI-CLP выявляется у пациентов с благоприятным прогнозом (отсутствием отдаленных метастазов), что подтверждает потенциальную значимость SI-CLP в качестве противоопухолевого агента. Идентифицированы фенотипы внутриопухолевых макрофагов по двойным маркерам с помощью конфокальной микроскопии, ассоциированные с ответом на химиотерапию рака молочной железы.

Аннотация отчета за 2017 год

Целью проекта в целом является разработка инновационных инструментов генотерапии на основе альфавирусных векторов, экспрессирующих хитиназо-подобный белок SI-CLP для активации противоопухолевой функции опухолеассоциированных макрофагов и ингибиции опухолевого роста. Российской группой были проведены исследования по выявлению специфических фенотипических маркеров опухолеассоциированных макрофагов, связанных с резистентностью опухоли молочной железы к химиотерапии. Для понимания механизмов влияния макрофагального фенотипа на резистентность опухоли к химиотерапии необходимо понять, как влияют макрофаги опухолевого микроокружения на генетический ландшафт опухоли (по оценке частоты числовых генетических нарушений- Copy number aberration- CNA), который отражает феномен внутриопухолевой гетерогенности. Впервые обнаружена связь макрофагального фенотипа с частотой CNA в целом и по отдельным локусам ключевых генов, вовлеченных в реализацию эффекта лечения (ТР53, АТМ, BRCA1) и резистентность к химиотерапии (АВС-транспортеры). Мы также впервые показали увеличение частоты CNA в этих локусах у пациентов с более высоким уровнем макрофагов М2 (фенотип YKL-39+/CCL18+), что может объяснить более высокую противоопухолевую эффективность терапии, установленную нами ранее для таких больных. Также получены новые данные о прямой связи количества М2 макрофагов (экспрессирующих стабилин 1) со снижением экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости, которые указывают на принципиальную возможность макрофагального микроокружения опухоли up- и down регулировать активность АВС-транспортеров.
Выявлена положительная связь макрофагальных фенотипов SI-CLP-/CD163+ и SI-CLP+/CD206+ с эффективностью предоперационной химиотерапии. Получены оригинальные данные о том, что низкая экспрессия SI-CLP связана с высоким уровнем метастатических клонов опухолевых клеток, то есть с высоким риском отдаленного метастазирования. Все это указывает на потенциальную значимость этой молекулы в регуляции макрофагального функционала в условиях химиотерапии и в целом при опухолевой прогрессии. Сотрудниками лаборатории молекулярной вирусологии Латвийского научного биомедицинского центра (Latvian Biomedical Research and Study Centre, Riga) с помощью трансфекции альфа-вектора с геном SI-CLP были получены супернатанты клеток, содержащие белковый продукт данного гена. Мы показали, что альфавирусный SI-CLP оказывал дифференцированный эффект на миграцию моноцитов в модельной системе моноцитов ex vivo, полученных от пациентов с раком молочной железы, что делает актуальным изучение механизмов действия SI-CLP на моноциты и макрофаги. Это также указывает на возможность персонификации терапии на основе альфавирусного SI-CLP. Мы отработали сортировку клеток – моноцитов крови и опухолеассоциированных макрофагов на клеточном сортере MoFlo XDP. Несмотря на небольшой выход макрофагов, но высокую (100%) чистоту получаемой популяции, данный метод оптимален для исследования генетического материала указанных клеток.
Полученные данные оригинальны и служат основой для следующих этапов исследований по изучению влияния макрофагального фенотипа опухоли на экспрессию генов стволовости и эпителиально-мезенхимального перехода в опухолевых клетках молочной железы и оценки прямого эффекта SI-CLP на функциональное состояние и экспрессионный профиль моноцитов в модельной системе ex vivo. Соответствующие исследования позволят ответить на вопрос по определению показаний к использованию терапии на основе альфавирусного SI-CLP.


Документация:

СОГЛАШЕНИЕ

Договор

Публикации ERENET 2016-2018

Аннотация проекта